한국 재래계의 HNF4α 유전자 내 SNP와 성장과의 연관성 분석

서 론

한국 재래계는 증체율이 높지 않아 외래계에 비해 경제성은 떨어지지만 특유의 풍미와 식감을 가지고 있으며, 육계에 비해 우수한 영양 품질을 가져(Choi, 2000; Choe et al., 2010; Jeon et al., 2010; Kim et al., 2013) 자국민에게 선호도가 높다(Jayasena et al., 2013; Jayasena et al., 2014). 최근 닭고기는 소, 돼지고기에 비해 생산폭의 증가가 크며, 가격적 요인으로 인해 접근성이 좋아 소비량이 급증하는 추세이다(Nam et al., 2010).

Hepatocyte nuclear factor 4, alpha(HNF4α) 유전자는 사람과 닭의 20번 염색체상에 위치하며, 사람에서는 HNF4α 유전자의 변이가 췌장 세포의 발달과 분화에 따른 인슐린의 분비 조절, 제2형 당뇨병의 발현 등과 연관되어 있으며, 간세포 분화, 약물 및 지질 대사에 관련되어 있다(Argyrokastritis et al., 1997; Ellard et al., 2006; Lee et al., 2008; Wang et al., 2008; Kim et al., 2009; Woodfint et al., 2017). 닭에서 HNF4α 유전자는 특정 약물에 의해 전사 조절이 가능하며, 담즙산 수치의 지속적 증가를 방지할 수 있으며(Wang et al., 2005), 또한 Ahmed 등(2015)은 배아기에 간에서 HNF4α 유전자의 mRNA 발현이 높은 닭의 성장이 대조구에 비해 유의적으로 빠르다고 보고하였다. Silva 등(2012, 2013)은 HNF4α 유전자 6번째 intron의 A543G SNP을 PCR-RFLP 방법을 통하여 분석하여 해당 SNP이 육계의 날개 발달과 지방대사에 유의적 연관성이 있다고 보고하였으며, Choi 등(2016)은 A543G SNP이 한국재래계의 산육형질에 미치는 영향에 대하여 조사하여 이 SNP가 재래계의 성장에 유의적 영향을 미친다고 보고하였다. 이와 같은 선행 연구들의 결과는 HNF4α 유전자가 닭의 산육형질에 유의적 영향을 미칠 가능성이 있음을 시사하였으나, HNF4α 유전자의 A543G SNP에 대한 정확한 위치는 보고되지 않았다.

따라서 본 연구는 기존의 A543G SNP가 한국재래계의 체중과 유의한 연관성이 있었음을 상기하며, 닭의 20번째 염색체상에서의 A543G SNP의 정확한 위치를 파악하고, 주변의 SNP를 탐색하여 체중과 관련된 유의한 추가적인 HNF4α 유전자 내 분자 마커를 발굴하여 재래계의 성장률 개선에 활용할 수 있는 유전정보를 제공하고자 한다.

재료 및 방법

결과 및 고찰

사람의 20번 염색체에 위치한 HNF4α 유전자는 인간의 장내 항상성 및 기능성 유지에 중요한 역할을 하고, 간 특이적 유전자의 중요한 발생, 전사 인자로써 간세포의 분화 및 간에서의 약물 대사 효소를 조절한다(Argyrokastritis et al., 1997; Lee et al., 2008; Yang et al., 2014; Woodfint et al., 2017). 뿐만 아니라 HNF4α는 지질대사와 연관된 유전자로 Handschin 등(2005)은 HNF4α 유전자가 콜레스테롤 대사와 연관된 CYP7A1(cholesterol 7-hydroxylase)의 발현에 영향을 미친다고 보고하였으며, Kwon 등(2016)은 이 유전자의 메틸화 수준이 비만을 예측할 수 있는 지표로 활용할 수 있다고 보고하였다. 이와 같이 사람에서 HNF4α 유전자의 연구는 다수 이루어졌지만, 닭과의 연관성 연구는 미흡한 수준이다. 닭에서의 HNF4α 유전자 연구 중 Ahmed 등(2015)은 느리게 성장하는 닭의 배아보다 빠르게 성장하는 닭 배아의 간에서 HNF4α 유전자의 mRNA 발현이 유의적으로 높음을 확인하였지만, 어떠한 기작이 성장에 영향을 미치는지를 밝혀내지는 못했다.

Silva 등(2012)은 HNF4α 유전자가 사람의 지질대사를 조절함에 착안하여 육계의 지방대사와 연관된 마커의 확인을 위해 닭의 20번 염색체에 위치한 HNF4α 유전자의 inrton 6 상에 위치한 SNP를 PCR-RFLP를 이용하여 분석하였고, 해당 SNP의 이름을 A543G라고 명시하였다. 이 선행논문은 HNF4α 유전자 내 intron 6에 위치한 SNP A543G가 외래육계의 날개성장 및 복부 지방에 유의적 연관성이 있음을 밝혀냈다. 또한 Choi 등(2016)은 한국 재래계에서 HNF4α 유전자의 A543G SNP을 대상으로 생시체중에서 40주령 체중까지 유의적 연관성이 있음을 보고하여 HNF4α 유전자가 한국재래계에서 체중과 관련된 후보 유전자로서 작용할 수 있음을 시사하였다. 하지만 Silva 등(2012, 2013)은 729 bp의 PCR 증폭 산물의 크기와 제한효소에 관한 정보만 제공하였고, A543G SNP에 대한 정확한 위치를 명시하지 않았다. 이후 한국재래계를 대상으로 한 Choi 등(2016)의 실험에서는 전기영동결과와 NCBI database의 유전정보를 기반으로 하여 729 bp의 증폭산물의 크기와 제한효소에 의해 나타난 절편의 길이를 제공하였다(185 bp, 544 bp). 하지만 PCR-RFLP 실험방법의 한계로 유전자마커의 정확한 위치를 파악하기에는 어려움이 있었다.

본 연구에서는 HNF4α 유전자의 부분 염기서열분석을 위해 128수의 한국재래계 DNA를 이용하였으나, 17개의 시료가 PCR에 의해 증폭되지 않아 111개의 시료를 이용하여 분석을 진행하였다. 적색야계(Red Jungle fowl, inbred line UCD001)을 대상으로 분석된 NCBI의 데이터베이스(NC_006107.4)에 의하면 닭의 HNF4α 유전자상의 5,566,470∼5,567,096번째 염기서열 안에 총 21개의 SNP의 존재가 보고되었다. 한편, 한국 재래계를 대상으로 동일 위치의 염기서열 분석한 결과, 한국재래계의 염기서열내에서 14개의 SNP가 존재를 확인하였다(Fig. 1, Table 2). 기존에 보고된 SNP와 비교하였을 때, NCBI상에 등록된 8개 SNP를 확인할 수 없었으며, 1개의 기보고되지 않은 새로운 SNP을 발견하였다. 이러한 닭의 동일한 유전자 위치에서 발생하는 SNP의 차이는 한국 재래계와 외래계간의 유전적 차이에 기인한 것으로 사료되며, 이는 외래계를 대상으로 기존에 조사된 유전자마커가 한국재래계의 경제형질 증진에 대한 효과가 기대에 미치지 못할 수도 있는 점을 시사하는 것으로 한국재래계에 적합한 유전자마커 개발의 필요성을 역설하는 바이다.

Fig. 1. SNPs were detected by sequencing in HNF4α gene of Korean native chickens. * SNPs that showed to have a significant association with body weight in Korean native chickens.

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본 연구에서 A543G SNP의 위치파악을 위해서 선행논문에 제공된 primer 정보와 제한효소 자리를 토대로 SNP의 위 치를 추정하여 해당 부위의 염기서열을 확인한 결과, SNP의 NCBI 데이터베이스 상에서의 A543G SNP의 이름은 rs731246957이며, 위치는 5,566,970이고, 해당 SNP의 유전자형은 T와 C로 나타났다. Silva 등(2012, 2013)과 Choi 등(2016)에서 SNP의 유전자형을 A와 G로 표기한 것은 NCBI의 HNF4α 유전자 염기서열 정보(NC_006107.4)가 음성가닥으로 제공되는 것에 기인한 것으로 사료되며, SNP database (db SNP)에서는 양성가닥을 기준으로 기존의 단일염기와 변이를 표현하기 때문에 T와 C로 나타난다. 따라서 A543G SNP은 닭의 20번 염색체의 5,566,970번째 염기서열에 위치하며, 해당 위치는 HNF4α 유전자의 intron 6의 249번째 염기상에 위치하며, T/C로 이루어진 2가지 allele을 가지게 된다.

rs731246957 SNP는 한국재래계 내에서 TT 유전자형이 TC 및 CC 유전자형에 비해 사육 초기부터 40주령까지 증체량이 높게 나타났으며, TT형이 CC형에 비해 약 1.5배 가량 높은 체중 증가치를 보인다고 보고된 바 있다(Choi 등, 2016). 이러한 연구결과는 rs731246957 SNP가 외래육계뿐만 아니라, 한국재래계를 대상으로 한 체중관련 분자마커로서 활용될 수 있음을 시사하는 바이며, 시퀀싱을 통하여 분석한 본 연구결과에서도 선행연구와 유사한 유전자형 빈도 및 체중과의 연관성을 얻어내 선행 실험의 연구재현성을 입증할 수 있었다(Fig. 1, Table 3).

Silva 등(2012, 2013)과 Choi 등(2016)에 의해 외래육계 및 한국재래계의 육량형질과의 연관성이 보고되었던 rs731249757과 223 bp 거리에 위치한 rs736159604 SNP는 선행논문들에서 닭의 경제형질과의 어떠한 연관성도 밝혀지지 않았던 SNP로 발현 양상이 Choi 등(2016)이 한국재래계 대상의 성장형질 증진 마커로 보고하였던 rs731246957 SNP와 유사하게 나타났다(Table 3).

또한 rs736159604 SNP의 유전자형에 따라 생시체중부터 40주령 체중까지 재래계의 전체 성장기간 동안 닭의 체중에 통계적으로 유의미한 차이가 나타나는 것을 확인하였다(P<0.001)(Table 4). rs736159604 SNP의 GG 유전자형 그룹의 체중이 GA, AA 유전자형 그룹에 비해 생시체중부터 40주령 체중까지 유의하게 높은 관측치를 유지하며, 전체 사육기간 중 약 6 g에서 최대 1,700 g까지 높게 나타났다. 특히 40주령 체중에서는 GG 유전자형 그룹이 AA유전자형 그룹보다 약 1.8배 높은 체중 관측치를 보이며, 사육기간이 길어질수록 rs736159604 SNP의 유전자형에 따른 체중이 차이가 커지는 것을 확인할 수 있었다(Table 4). 이러한 결과는 기존의 선행연구들에서 체중과의 연관성이 밝혀지지 않은 rs726159604 SNP가 기존에 연구되었던 rs731246957 SNP와 함께 한국재래계에 있어서 생시체중 및 증체와 같은 산육 특성 마커로 활용할 수 있을 것이며, 재래계의 시장 경제성을 높이기 위한 선발 및 육종에 적합한 유전자 마커로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서 최초로 발견한 novel SNP은 닭의 20번 염색체 상의 5,567,012 bp의 염기에 존재하며, 이는 HNF4α 유전자의 intron 6상의 249번째 염기에 해당한다. 따라서 신규 발견한 해당 SNP을 ‘intron 6(249)’라고 명명하였다. NCBI의 데이터베이스의 reference 종으로 제시된 적색야계에 존재하지 않는다. 새로 발견된 SNP는 발현 빈도가 낮고 실험에 사용된 계군내에서는 hetero형(GT)만 확인되었으나(Table 3), 두 개의 유전자형간의 통계적인 유의미함을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이러한 새로운 SNP에 대한 정보는 한국 재래계의 유전적 기초 자료로서의 의미를 가지며, 보다 많은 실험 개체를 추가하여 후속실험을 진행할 필요가 있다고 사료된다.

Fig. 2. Variation of mean body weight according to genotype of intron 6 (249) SNP. * Indicates significant difference between genotypes (* P<0.05; ** P<0.01).

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결론적으로 HNF4α 유전자는 한국재래계의 성장과 연관된 후보유전자로써 rs731246957과 rs736159604 SNP, 새로이 발견된 SNP인 intron 6(249)의 특정 유전자형이 재래계의 생시체중 및 주차별 체중에 유의적 연관성을 보인 바, 한국 재래계의 경제형질 개량을 위한 선발 육종에 유용한 유적적 마커로서 활용 가능할 것이며, 본 실험 결과를 적용하여 재래계의 계통 선발에 이용한다면 산육겸용종으로 이용되는 한국재래계를 외래계와 같이 산란 또는 산육에 특화 된 실용계 개발 및 우수한 종계 개발에 도움이 될 것이라 판단된다.

적 요

HNF4α유전자는 인간의 지질 수송 및 대사에 관여하는 간 전사인자로써, 닭의 지방 축적에 관련된 잠재적 후보유전자로 선정하였다. 선행연구에서 보고된 HNF4α 유전자 내 A543G SNP은 외래 육계뿐만 아니라, 외래 육계와 유전적 차이를 가지는 한국 재래계의 생시체중과 생체중에 유의적 연관성을 보인 바 있으나, 해당 SNP의 정확한 위치는 보고 된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 sequencing을 통하여 A543G SNP의 정확한 위치를 파악하고, A543G SNP의 주변 부위의 한국 재래계의 산육형질에 유의적 연관성이 있는 SNP을 파악하고자 하였다. Genomic DNA는 128수의 한국재래계의 혈액을 이용하여 추출하였으며, PCR 뒤 sequencing에 사용되었다. Sequencing 결과, 증폭범위 내에서 총 14개의 SNP가 탐색되었으며, 이 중 HNF4α 유전자의 intron 4 상에서 기존에 보고되지 않은 1개의 새로운 SNP를 발견하였다. 확인된 14개의 SNP 중 rs731246957과 rs736159604가 재래계의 생시체중 및 생체중에 유의적 연관성(P<0.001)을 보였다. rs731246957은 닭의 20번 염색체의 5,566,970번째에 위치하며, 선행논문에서 체중과의 연관성이 보고된 A543G SNP인 것으로 확인되었으며, 기존의 연구결과와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 반면에 선행논문에서 닭의 성장형질과의 연관성이 보고된 적 없는 rs736159604 SNP는 GG 유전자형 그룹이 GA, AA 유전자형 그룹에 비해 꾸준히 높은 체중 관측치를 보였으며, 특히 40주령의 체중은 다른 유전자형 그룹에 비해 약 1.8배 높게 관측되었다. 뿐만 아니라 신규 발견한 SNP의 T allele을 가지는 계군이 G allele을 가지는 계군보다 성장면에서 고능력을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 한국재래계의 산육형질과 연관된 후보유전자로써 HNF4α 유전자의 기초정보를 제공하며, 해당 유전자내 특정 단일염기의 변이가 재래계의 체중 관련 유전자 마커로 유용하게 활용 가능할 것을 시사한다.