MS 마커를 활용한 지역별 오계 유전자원의 다양성 및 유연관계 분석

본 연구에 이용된 공시재료로는 연산오계 집단과 국립축산과학원 가축유전자원센터 및 각 지역의 4개 기관(충북, 충남, 경북, 서울대)에서 보존되고 있는 오계 집단과 대조구로 외래 도입 토착종 3개 집단(레그혼, 코니시, 로드아일랜드), 총 9개 집단 243수를 이용하였으며(Table 1), 익하정맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 통해 DNA를 추출하였다.

집단별 다양성 분석을 위해 사용한 MS marker는 ISAG/ FAO(FAO, 2004)에서 권고하고 있는 MS marker 10종(ADL 0278, LEI0094, LEI0166, LEI0192, MCW0016, MCW0037, MCW0078, MCW0206, MCW0295, MCW0330)과 Roslin Bioinfomatics Group에서 제공하는 ArkDB database website를 참고하여 다양성이 높게 보고된 15종(ADL0176, ADL0262, ADL0267, LEI0092, LEI0096, LEI0099, LEI0135, MCW0103, MCW0145, MCW0193, MCW0214, MCW0233, MCW0240, MCW0252, MCW0301)의 마커를 선별하여 총 25종을 이용 하였다.

추출된 DNA는 UV Spectrophotometer(NA-1000, Nanodrop)을 이용해 농도를 측정한 후, 최종 10 μL/μg이 되도록 증류수에 희석하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 각 마커별 증폭산물의 크기와 형광표지 등을 고려하여 2∼6개씩 Multiplex 조합을 만든 후, DNA 중합효소, dNTP, KCL, MgCl₂ 등이 포함되어 있는 AccuPower^TM Negative dye PCR PreMix(Bioneer, Korea)를 이용하여 주형 DNA 2ul, primer는 각각의 multiplex 조합별로 조건에 맞게 0.4∼2.6 μL(2 pmole/μL)를 첨가하고, 최종부피가 20 μL가 되도록 증류수를 첨가한 후, multiplex PCR을 수행하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였으며, 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 60초간 denaturation, 각 조합에 따라 55∼62℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension을 35회 반복한 후 72℃에서 30분 동안 final extension을 실시하였다.

증폭된 PCR 산물은 Hi-Di Foramide(Applied Biosystems, USA)와 GeneScan 500Liz Size Standard(Applied Biosystems, USA)를 혼합하여 10분 동안 95℃에서 변성(denaturation)시킨 후 즉시 얼음에 넣어 상태를 유지하게 하였다. 그 다음 자동 염기 서열 분석 장치인 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)에 장착하여 POP 7 polymer (Applied Biosystems, USA)상에서 모세관 전기영동을 통해 분석하였다. 각 마커별 대립유전자들의 크기는 GeneMapper version 5.0 software(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였고, 크기가 결정된 좌위들은 공시된 개체별로 Microsoft Excel(Microsoft, ver 2010, USA)을 이용하여 자료를 취합한 후 각 통계분석 방법에 적용하였다.

크기가 결정된 마커별 대립유전자들은 MS tool Kit(Park, 2000)을 이용하여 마커 및 집단별 관측이형접합도(H_obs), 기대이형접합도(H_exp), 다형정보지수(PIC) 등을 계산하였다. 집단간 유전 거리 추정을 위해서는 PHYLIP program pakage (Felesenstein, 2010)을 통해 Nei 등(1983)의 방법을 이용하여 산출하였으며, 이를 토대로 집단별 Neighbor-Joining phylogenetic tree를 작성하였다.

집단의 유전적 균일도 추정은 STRUCTURE software (Pritchard et al, 2000)을 이용하였으며, 구분 가능한 집단 수(K값)을 추정하기 위해서 K를 2부터 9까지 설정하고, 각 값에 대한 평균 추정치 Pr(X│K)와 표준편차를 계산하고, burn-in 20,000회, MCMC (markov chain monte carlo) 반복수 100,000회, 이를 10회 반복하여 계산된 결과를 Evanno 등(2005)의 방법이 적용된 STRUCTURE HARVESTER(Earl and von-Holdt, 2012)를 사용하여 ΔK 값을 계산하여 최적의 K값을 결정하였으며, CLUMMP(Jakobsson and Rosengerg, 2007)를 이용해 10회 반복하여 나온 최적의 K값에 대한 cluster별 유전적 균일도를 계산하였고, 이후 각 cluster에 대한 집단의 실제 분포를 DISTRUCT(Rosenberg, 2004)를 이용하여 도식화하였다.

25개 MS 마커를 이용하여 6개 오계 집단 및 3개 외래토착종 집단을 포함하여 총 9개 집단 243수에 대한 마커별 대립유전자 수(NA), 기대이형접합도(H_exp), 관측이형접합도(H_obs), 다형정보지수(PIC)를 Table 2에 제시하였다. 25개의 마커에서 2∼10개의 범위로 총 153개의 대립유전자가 나타났으며, 마커별 평균 6.12개의 대립유전자를 보유하고 있는 것으로 확인되었다. MCW0145의 경우, H_exp와 PIC가 각각 0.640, 0.570으로 가장 높게 나타났으며, H_obs는 MCW0240에서 0.638로 가장 높게 나타났다. 반면, LEI0166에서는 H_exp, H_obs, PIC 각각 0.248, 0.204, 0.202로 가장 낮은 수치를 보이고 있었다. 한편, MCW0145의 경우, 우리나라 재래닭 및 외래토착종을 대상으로 진행한 여러 논문(Kong et al., 2006; Seo et al., 2013; Suh et al., 2014)에서도 높은 다형성을 나타내고 있는 것으로 보고되었다.

Table 3에서는 집단별 다양성 분석 결과를 제시하였다. 가장 많은 대립유전자를 보유하고 있는 집단은 YSO(4.08)로 나타났으며, RIR 집단(2.84)에서 가장 적은 대립유전자를 보유하고 있는 것으로 확인되었다. H_exp와 H_obs의 경우, SUO 집단에서 각각 0.607, 0.601로 가장 높은 수치를, LG 집단에서 0.399, 0.361로 가장 낮은 수치를 보이고 있었으며, 전반적으로 6개 오계 집단이 외래토착종에 비해 높은 다양성을 나타내고 있었다. 이는 외래토착종의 경우, 우리나라에 도입된 뒤 수십 년 이상의 세대갱신을 지속함으로써 유전적 고정화 작업이 이루어졌기 때문인 것으로 사료된다.

공시된 9개 집단간의 유전적 거리를 추정하기 위해 마커별 대립유전자의 빈도를 바탕으로 PHYLIP program package를 이용하여 Nei 등(1978)의 방법을 통해 계산된 집단간 유전거리를 Table 4에 제시하였다. 분석 결과, YSO 집단과 SUO 집단 사이에서 0.073으로 가장 가까운 것으로 나타났으며, 외래토착종인 LG 집단과 CBO 집단 사이에서 0.937로 가장 먼 유전거리를 보이고 있었다. 특히 오골계 집단의 경우, 서로 0.5이내의 범위의 유전거리를 나타내고 있었으며, 3개의 외래토착종 중 CN 집단과 가장 가까운 유전거리를, LG 집단과 가장 먼 유전거리를 나타내고 있음을 확인하였다. 오재돈 등(2008), 이풍연 등(2011), 서상원 등(2014)의 보고에서도 오계 집단이 외래토착종 중 코니시 집단과 가장 가까운 유전거리를 형성하고 있는 것으로 보고되었다.

각 집단의 분포를 확인하기 위해 유전적 거리를 바탕으로 PHYLIP program package을 이용하여 집단간 Neighbor-Joining phylogenetic tree를 작성하여 Fig. 1에 제시하였다. 분석 결과, 3개의 외래토착종 집단이 각각 별도의 가지를 형성하고 있었으며, 오계 집단의 경우 집단간 큰 차이를 보이지는 않았지만, GBO 집단의 경우 비교적 별도의 그룹을 형성하고 있음을 확인하였다.

Fig. 1. Neighbor-Joining Phylogenetic tree showing genetic relationships among 9 chicken populations based on Nei distances. YSO: Yeonsan Ogye, ARO: Animal Genetic Resources Research Center Ogye, CBO: Chungbuk Ogye, CNO: Chungnam Ogye, GBO: Gyengbuk Ogye, SUO: Seoul National University Ogye, RIR: Rhode Island Red, LG: White Leghorn, CN: Cornish

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공시된 9개 집단이 실제로 몇 개의 군집으로 구분이 가능한지를 살펴보기 위해 Bayesian clustering법이 적용된 Structure software를 이용해 K값을 2부터 9까지 설정하였고, 분석 후 나온 데이터를 바탕으로 STRUCTURE HARVESTER를 이용해 Evanno(2005)의 방법으로 최적의 K값을 계산한 결과, K=3에서 가장 높은 ΔK값(7.96)을 얻을 수 있었다. Table 5에서는 K=3일 때의 각 집단별 유전적 균일도를 나타내었으며, Fig. 2에서는 집단별 군집 형성 양상을 도식화하여 나타내었다. 분석 결과 YSO, ARO, CBO, CNO, SUO 집단은 1번 군집에서 97% 이상의 매우 높은 균일도를 보였으나, GBO 집단의 경우 34.0%의 균일도를 나타내었고, 3번 군집에서 65.3%로 가장 높은 균일도를 나타내고 있었다. 외래 토착종의 경우, CN 집단이 3번 군집에서 97.3%, LG 집단이 2번 군집에서 99.5%로 높은 균일도를 보이고 있었으며, RIR 집단의 경우 3번 군집에서 89.6%의 균일도를 나타내고 있었다. 이는 Fig. 1에서의 결과와 매우 유사한 양상을 보이는 것으로 확인되었다. 한편, 유전거리 분석 결과에서는 오계집단과 코니시 집단이 비교적 가까운 거리를 나타내고 있었지만, 균일도 분석 결과 서로 뚜렷하게 구분되는 집단임을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 오계집단의 경우, 외래토착종과는 구분 되는 품종임을 확인할 수 있었다. 또한, GBO 집단을 제외한 YSO 집단 및 5개 지역의 오계 집단은 하나의 군집을 형성하고 있었으며, GBO 집단의 경우 두 개(Cluster 1, 3)의 군집에 걸쳐 분포하는 것을 확인할 수 있었다. GBO 집단은 나머지 4개 지역 오계 집단과 같은 연산오계에서 유래된 집단이며, 표현형적 특징에서도 타집단과의 차이점이 나타나지 않았다. 하지만 유전적인 특징에서는 타집단과는 서로 다른 양상을 나타내고 있었으며, 이는 일부 개체에서 타집단과의 교잡이 일어나 균일도가 떨어진 것으로 보인다. 따라서, 추후 균일도를 높이기 위해 개체 식별 및 계획 교배를 통한 지속적인 유전적 고정화 작업이 필요할 것으로 사료된다. 전체적으로, 각 지역별 오랜 시간 분포되어 사육되었기 때문에 유전적 다양성 측면에서는 다소 차이를 보이고 있었으나, GBO 집단을 제외하면 유전적 균일도 측면에서 큰 차이점이 없는 것으로 보아, 각 지역에서 적절하게 계통을 유지하며 사육되었음을 확인할 수 있었으며, 국가 수준의 유전자원 보존을 위해 지속적인 관리가 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 2. Clustering assignment of the 9 chicken populations obtained by STRUCTURE analysis (K=3). YSO: Yeonsan Ogye, ARO: Animal Genetic Resources Research Center Ogye, CBO: Chungbuk Ogye, CNO: Chungnam Ogye, GBO: Gyengbuk Ogye, SUO: SEoul National University Ogye, RIR: Rhode Island Red, LG: White Leghorn, CN: Cornish.

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