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서 론
국제 곡물가, 원유가 및 수송비용은 지난 15년간 지속적으로 상승하여 국내 사료업계에서는 사료 원재료비 절감에 대한 압박을 심하게 받고 있다. 특히 수입의존도가 지나치게 높은 점과 곡물 수요 경쟁이 치열해지는 상황에서 다양한 원료의 개발과 효율적 이용에 대한 관심이 높아지고 있다. 그러나 가격 경쟁력을 갖춘 원료라고 하더라도 옥수수-대두박에 비하여 에너지와 영양소 이용성이 상대적으로 낮은 단점을 보완하고 항영양인자를 저감시키지 않는다면 신규 원료의 적용은 제한적일 수밖에 없다(Bedford and Schulze, 1998). 특히 소맥과 대맥 등 옥수수를 대체할 곡류에는 섬유소를 비롯한 비전분 다당류(non-starch polysaccharide; NSP)가 함유되어 있어서 특히 가금의 성장과 생산성을 저하시키는 단점을 가진다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 amylase, xylanase, β-glucanase 등의 외인성 효소제를 가금 사료에 사용하는 것이 유리하다고 알려져 있다(Chesson, 2001).
사료 분야에서 효소제의 개발 및 적용은 1950년대부터 활발히 수행되었다. 초기에는 보리를 기초로 하는 사료에서 β-glucanase를 적용하는 실험을 시작으로 해서 소맥의 xylan을 분해하는 xylanase의 개발까지 다수의 연구가 이루어졌다. 실제로 효소제의 초기 연구는 개발된 효소제품의 활성과 기질 특이성에 대한 이해에 초점이 맞추어져 있었다(Choct, 2006). 특히 효소 및 그 기질에 대한 이해가 명확해지고 미생물 공학이 발달함으로써 가금 사료 내 효소제품의 사용이 통상적으로 이루어져 왔다. 닭에서 장 내 점도를 높이는 원료들을 이용할 때 단일 효소제 또는 복합 효소제를 적용함으로서 영양소 소화율을 높이고 성장 성적을 개선시킬 수 있다는 결과들이 보고되었다(Hesselman and Aman, 1986; Gao et al., 2007). 그 외에도 사료비 절감, 항영양인자의 분해와 환경 부담 감소는 효소제의 적용을 통해 얻을 수 있는 부가적인 효과이다(Cowieson and Ravindran, 2008). 본 연구에서는 대사에너지와 조단백질 수준을 낮춘 조건에서 다양한 시판 효소제를 적용하는 사양실험을 통해 성장성적과 생리적 반응에 미치는 영향을 조사하였다.
재료 및 방법
본 연구의 동물실험은 건국대학교 동물실험윤리위원회(IACUC) 규정에 따라 진행되었다(승인번호: KU19109).
1일령 Ross 308 육계를 동일한 사양조건에서 시판사료의 초이사료(대사에너지, 3,000 kcal/kg; 조단백질, 21%)로서 1주일간 예비 사육하고, 7일 차에 공시계의 체중을 측정한 후 펜별 평균 체중이 유사하도록 완전임의배치법을 이용하여 구배치를 하였다. 옥수수-소맥-대두박을 기초로 하여 대사에너지와 조단백질 수준을 Ross 308의 권장 수준에 유사하도록 배합한 사료를 대조구(Control)로 하였고, 대사에너지를 100 kcal/kg 낮추고, 조단백질 수준을 1.0% 저감시킨 조건에서 4종의 효소제품을 각각 첨가한 실험사료 급여구(T1~T4)로 구분하였다. 시판 효소제 A(xylanase, 4,000 μ/g; α-amylase, 400 μ/g; protease, 8,000 μ/g), 효소제 B(β-mannanase, 800 μ/g), 효소제 C(xylanase, 2,200 μ/g; β-glucanase, 200 μ/g), 효소제 D(xylanase, 1,000 μ/g)를 실험사료 내에 0.05% 수준으로 동일하게 첨가하였다. 21일령까지 전기사료(starter diet)를, 이후 28일령까지 후기사료(grower diet)를 급여하였다(Table 1 and 2). 실험사료 제조 후 일정량을 취하여 일반성분, 칼슘과 인 함량을 분석하였다(AOAC, 1990).
1 Vitamin and mineral mixtures provided the following nutrients per/kg feed: vitamin A, 80,000 IU; vitamin D3, 1,600 IU; vitamin E, 20 IU; vitamin K3, 8 mg; vitamin B1, 8 mg; vitamin B2, 24 mg; vitamin B6, 12 mg; vitamin B12, 0.040 mg; pantothenic acid, 40 mg; folic acid, 4 mg; nicotinic acid, 120 mg, Fe, 60 mg: Zn, 50 mg; Mn, 60 mg; Co, 0.3 mg; Cu, 10 mg; Se, 0.2mg.
공시 병아리들은 톱밥을 깔짚으로 사용한 30개의 floor pen(가로 × 세로 × 높이: 180 × 180 × 200 cm)에 25수씩 수용하였다(5처리, 6반복으로 총 750수 공시). 사료 급이기는 펜별로 1개씩, 급수 니플의 수도 펜별로 동일하게 배치하였다. 실험사료와 물은 자유 채식 및 자유 음수로 하였고, 전 사양기간 동안 24시간 종일 점등하였다. 입추 후 1일령의 계사 내 온도는 33°C로 하였고, 주당 4°C씩 감온하여 이후에는 20°C를 유지하였다.
주 1회 반복구별로 모든 공시계의 펜별 체중과 사료 섭취량을 조사하였다. 해당 실험기간 중의 사료섭취량을 총합하여 증체량과 대비하여 사료요구율을 계산하였다. 주별 체중을 근거로 성장곡선에 따른 생체 1.5 kg 도달 예측 일령을 구하였다.
사양실험 종료 후(실험 4주차)에 각 반복구별로 평균 체중에 해당하는 공시계를 1수씩(처리당 6수) 선발하여 익하정맥 채혈을 하고, 혈청분리 진공튜브에 담았으며, 채혈 당일 원심분리(HA 1000-3, 한일과학산업)하여 혈청을 얻었다. 혈액자동분석기(Hitachi LABOSPECT 008AS, Japan)를 이용하여 영양 지표로서 알부민, 글로불린 및 총단백질 농도를 분석하였다.
사양실험 종료 후(실험 4주차), 생체중 측정치의 평균에 해당하는 개체를 처리구별로 8수씩 선발하여 안락사시킨 후 맹장을 내용물과 함께 적출하여 냉동 보관하였다. 이후 멸균된 생리식염수에 현탁하여(Homogenizer T25, Janke and Kunkel type, Ika, Staufen, Germany)로 균질화한 후, 적당한 비율로 회석하여 측정용 시료로 사용하였다. 실험 처리에 의한 맹장 내의 총균수(total microbes), 유산균수(lactic acid bacteria) 및 대장균수(Coliforms sp.)를 측정하기 위하여 총 균수는 total plate count agar(Difco)를, 유산균수는 MRS agar(Difco)를, 대장균수는 MacConkey agar(Difco)를 사용하였고, 37°C에서 24시간 배양 후 균수를 측정을 하였다. 형성된 집락의 수가 약 10~100개 정도 되는 평판배지에서 형태학적으로 서로 다른 균을 3회 계대 배양을 통해 분리하였다. 사용한 primer는 27F(forward primer: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R(reverse primer:5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)을 사용하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 밝혔다. NCBI의 BLAST를 이용하여 Gene bank에서 유전자의 유사성을 분석하였다.
맹장 샘플을 얻기 위하여 희생시킨 개체에서 공장(십이지장 말단부터 메켈 게실까지)과 회장(메켈 게실부터 맹장 2 cm 전위 부위까지)의 내용물을 채취하였고, 점도 측정을 위한 시료로 이용하였다. 장 내용물 점도는 전용 점도계(Brookfield VISCOMETER DVⅡ+ Pro, USA)를 사용하여 측정하였다. 공시계별로 공장과 회장 내용물 1 g에 3차 증류수 900 μL를 넣고 4°C에서 9,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상층액 0.5 mL를 점도계 플레이트 중앙에 떨어뜨린 후 10 rpm의 회전 조건에서 30초 경과 시의 값을 기록하였다.
결과는 SAS(SAS Inst. Inc., Cary, NC)의 Proc MIXED를 이용하여 분석하였다. 모델의 고정변수는 실험사료이며, 임의변수는 반복으로 설정하였다. 개체 일령(X)에 따른 체중 (Y)을 각각 독립변수와 종속변수로 하여 2차 다항 회귀모델(Y = a0 + a1X2 + a2X2)을 엑셀로 표현하였고, 1.5 kg 도달 시 예측 일령 계산은 회귀 모델의 기울기와 절편을 통해 계산하였다. 성장 성적의 실험단위는 펜으로 하였고, 기타 분석항목은 개체로 하였다. 유의한 차이가 인정되었을 때 Duncan의 다중검정을 통하여 검정을 실행하였으며, 모든 분석의 통계적 유의차는 P<0.05로 설정하였다.
결과 및 고찰
에너지 및 조단백질 저감 사료 내 효소제 첨가 급여가 성장 성적에 미치는 영향에 대한 결과를 Table 3에 나타내었다. 실험 개시 시의 체중은 처리간 유의차를 보이지 않았다. 전기 종료 시(21일령) 체중, 일당증체량과 사료섭취량에서도 처리간 유의한 차이를 보이지 않았다. 하지만 사료요구율은 효소제를 첨가한 처리구에 비하여 대조구에서 유의하게 낮은 결과가 관찰되었다(P<0.05). 중기사료를 급여한 21일령부터 28일령까지의 성장성적에서는 처리간에 큰 차이가 나타나지 않았다. 실험 기간의 생체중, 일당증체량과 사료섭취량에서는 처리간 유의한 차이는 없었으나, 사료요구율은 효소제를 첨가한 처리구에 비하여 대조구에서 유의하게 낮았다(P<0.05).
2 Control diet, commercial diet; T1, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 4,000 μ/g xylanase, 400 μ/g α-amylase, and 8,000 μ/g protease; T2, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 800 μ/g β-mannanase; T3, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 2,200 μ/g xylanase and 200 μ/g β-glucanase; T4, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 1,000 μ/g xylanase.
에너지 및 조단백질 저감 사료 내 효소제 첨가 급여가 1.5 kg 도달 일령에 미치는 영향에 대한 결과를 Table 4에 나타내었다. 대조구를 급이 받은 개체가 1.5 kg에 도달하기 위한 일령은 26.34일로 추정되었고, 효소제를 첨가한 처리구 T1, T2, T3 및 T4에서의 1.5 kg 도달 예상 일령 각각 26.79, 26.39, 26.83 및 26.84일로 추정되었으며, 통계적 유의차는 없었다. 이전 연구에서 조단백질을 낮춘 사료 내에 프로테아제 효소제를 첨가한 실험조건에서 대조구에 비하여 증체량이 유의하게 높아지는 결과를 관찰하였다(Mohammadigheisar and Kim, 2018). 반면 xylanase, β-glucanase와 pectinase로 구성된 복합 효소제를 성장 중인 닭에 7주간 급여한 연구에서는 증체의 유의한 개선 효과가 나타나지 않았으며(Francesch et al., 1995), 옥수수-보리-대두박 위주의 실험사료를 급여하는 조건에서도 효소제의 첨가가 증체와 출하체중에 크게 영향을 미치지 않았다는 상반된 결과가 보고된 바 있다 (Hashish et al., 1995).
2 Control diet, balanced diet; T1, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 4,000 μ/g xylanase, 400 μ/g α-amylase, and 8,000 μ/g protease; T2, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 800 μ/g β-mannanase; T3, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 2,200 μ/g xylanase and 200u/g β-glucanase; T4, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 1,000 μ/g xylanase.
시판 phytase는 육계 배합사료에 보편적으로 첨가하고 있어서 본 연구에서도 phytase를 적용하는 실험 조건을 부여하였다. 효소제 특히 xylanase를 phytase와 같이 사용할 때 두 효소가 간섭이나 상승적 효과를 발휘하지 않는 것으로 알려져 있다(Wu et al., 2004). 효소제의 급여에 따른 성장 반응의 차이는 효소제의 활성, 사료 내 기질의 함유 정도, 사료 내 에너지와 영양소 설계 수준, 사양 및 환경 조건에 따른 것으로 생각된다.
에너지 및 조단백질 저감 사료 내 효소제 첨가 급여가 혈액 성상에 미치는 영향에 대한 결과를 Table 5에 나타내었다. 사양실험 종료 후 채취한 혈액의 영양지표로서 조사한 albumin, globulin 및 total protein의 혈액 내 농도는 처리간에 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다. 대조구와 효소제 첨가구간에 성장에 큰 영향이 없었기 때문에 혈액 내 영양지표에서 차이가 없는 것은 예상된 결과일 것이다. 사육환경과 효소제 종류의 차이에 따라 혈액 내 영양지표에 결과가 다르게 나타날 수 있기 때문에 이에 대한 다양한 연구가 필요하다고 생각된다.
2 Control diet, balanced diet; T1, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 4,000 μ/g xylanase, 400 μ/g α-amylase, and 8,000 μ/g protease; T2, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 800 μ/g β-mannanase; T3, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 2,200 μ/g xylanase and 200 μ/g β-glucanase; T4, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 1,000 μ/g xylanase.
에너지 및 조단백질 저감 사료 내 효소제 첨가 급여가 맹장 내 균총 수에 미치는 영향에 대한 결과를 Table 6에 나타내었다. 이전 연구에서는 사료에 xylanase을 첨가하였을 때 맹장에서 Salmonella, Lactobacillus, Bifidobacteria를 증가시켰다고 보고하였다(Nian et al., 2011). 반대로 xylanase를 사료에 배합하였을 때 Lactobacillus 등 장내 균총 변화에 영향을 미치지 않았다(Lu et al., 2009). 또한, 본 연구와 유사한 이전 연구에서 조단백질 수준을 낮추고, 프로테아제 효소제를 급여하는 실험에서도 마찬가지로 총균수, 유산균수, 대장균수에서 유의적인 차이는 발생하지 않았다(Mohammadigheisar and Kim, 2018). 효소제 첨가 후 장내 균총을 조사한 연구는 매우 많았지만 상반된 결과가 보고되고 있어서 본 연구에서도 다양한 효소제를 적용하면서 맹장 균수와 염기서열 분석을 통해 장내 균총에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 계대배양으로 분리된 미생물을 16S rRNA sequencing으로 분석하여 각 처리구에서 배지별 우점 균을 Table 7에 명시하였다. 대조구에서는 Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecium, Lactobacillus johnsonii, E. coli가 주로 분리 동정되었다. T1에서는 대조구와 같은 유산균들이 확인되었고, Uncultured bacterium, Enterococcus sp.가 추가적으로 분리 동정되었다. T2에서도 Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecalis, Enterococcus lactis가 분리 동정되었다. T3에서는 대조구, T1 및 T2에서 분리 동정된 모든 균들이 분리되었으며, 다른 균들은 확인되지 않았다. T4에서는 대조구와 다른 처리구에서 분리 동정되지 않았던 Staphylococcus epidermidis, Uncultured Streptococcus sp. 및 Dermacoccus sp.가 확인되었다. PCA 배지에서는 모든 처리구에서 비슷한 유산균과 대장균이 확인되었다. MRS 배지에서는 C-T4까지 Lactobacillus salivarius, Lactobacillus johnsonii 2가지 유산균이 우점균이었으며, Lactobacillus salivarius는 병원성 세균인 대장균, 황색포도상구균 및 살모넬라균 등에 항균 작용을 하며(Lim et al., 2007), Lactobacillus johnsonii는 건강한 미생물의 일종인 유산균이며 생균제라는 특성이 있다(Lee et al., 2008). MAC 배지에서는 모든 처리구에서 동일한 E. coli 대장균이 확인되었으며, T3에서만 Proteus sp.가 확인되었다. 이는 창상감염의 원인균이다. 복합효소제의 급여가 육계의 장내 균총 수에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 영양소 수준이 다른 조건에서 또는 동일한 영양 조건에서도 적용하는 효소제에 따라 장내 우점균들이 상이해질 수 있음이 시사되었고, 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
2 Control diet, balanced diet; T1, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 4,000 μ/g xylanase, 400 μ/g α-amylase, and 8,000 μ/g protease; T2, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 800 μ/g β-mannanase; T3, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 2,200 μ/g xylanase and 200 μ/g β-glucanase; T4, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 1,000 μ/g xylanase.
2 Control diet, balanced diet; T1, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 4,000 μ/g xylanase, 400 μ/g α-amylase, and 8,000 μ/g protease; T2, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 800 μ/g β-mannanase; T3, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 2,200 μ/g xylanase and 200 μ/g β-glucanase; T4, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 1,000 μ/g xylanase.
에너지 및 조단백질 저감 사료 내 효소제 첨가 급여가 공장과 회장 내용물 점도에 미치는 영향에 대한 결과를 Table 8에 나타내었다. 공장 내용물의 점도에서는 처리간에 유의한 차이는 나타나지 않았다. 회장 내용물 점도는 T2 처리구가 대조구 및 다른 효소제 처리구에 비하여 유의하게 낮은 결과가 관찰되었다(P<0.05).
| Item | Jejunum | Ileum |
|---|---|---|
| ----- mPa.s ----- | ||
| Control | 4.18 | 5.50a |
| T1 | 4.62 | 4.87a |
| T2 | 3.69 | 3.74b |
| T3 | 4.73 | 5.38a |
| T4 | 4.77 | 5.18a |
| Pooled SEM3 | 0.36 | 0.36 |
| P-values | 0.195 | 0.014 |
2 Control diet, balanced diet; T1, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 4,000 μ/g xylanase, 400 μ/g α-amylase, and 8,000 μ/g protease; T2, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 800 μ/g β-mannanase; T3, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 2,200 μ/g xylanase and 200 μ/g β-glucanase; T4, diet with reduction of 100 kcal ME/kg and 1% of CP and addition of 1,000 μ/g xylanase.
장 내용물 점도가 높아지면 소화율이 저하되고, 이는 사료효율 및 성장에 많은 영향을 미친다. 이전 연구에서는 복합효소제와 동물성 및 식물성 단백질이 함유된 사료를 육계에 급여할 때 장 내용물 점도가 유의적으로 낮아진다고 나타내었다(Nagaraj and Bilgili, 2007). 반면 대두박 위주의 사료에 프로테아제가 포함된 복합효소제를 육계 사료에 급여할 때 장 내용물 점도에 유의적인 차이가 없다고 나타내었다(Kocher et al., 2003). 복합효소제 급여가 육계 공장, 회장 점도에 미치는 영향은 장 내용물 점도에 영향을 줄 수 있는 사료 조성인 소맥, 대두박 및 NSP 등의 함량과 사육환경의 차이로 인한 유의차가 발생하지 않은 것으로 생각된다. 다만 β-mannanase를 급여한 T2에서는 유의적으로 낮은 점도가 보였는데, 이러한 차이가 나타난 원인에 대해서는 추가적인 연구를 통해 밝혀야 할 것이다.
